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Détermination du volume capillaire pulmonaire par méthode en double diffusion NO-CO chez les enfants drépanocytaires. Etude pilote.

Aurélie BADOS (Travail réalisé sous la direction du Pr. A DENJEAN)

Unité INSERM 763 (Directeur : Pr. J ELION), Hôpital Robert Debré, Paris.

Introduction: l’atteinte pulmonaire dans la drépanocytose est habituellement évaluée par l’étude de la fonction respiratoire, qui n’inclut pas l’état vasculaire pulmonaire. Cette étude a porté sur l’évaluation du volume capillaire pulmonaire (Qc) chez des enfants drépanocytaires.

Matériels et méthodes: 45 enfants drépanocytaires et 15 témoins ont participé à l’étude. Nous avons évalué le Qc et la capacité de diffusion pulmonaire (Dm) par une méthode mesurant, de façon combinée, la capacité de diffusion pulmonaire du monoxyde d’azote (DLNO) et du monoxyde de carbone (DLCO). Nous avons étudié la reproductibilité à court terme de la mesure et la variation du Qc au passage de la position assise à la position couchée. Une analyse du monoxyde d’azote (NO) expiré, à débits unique et multiples, a complété l’étude.

Résultats: la population drépanocytaire présentait 20% de syndrome restrictif et 27% de syndrome obstructif. Le NO expiré chez les patients n’était pas différent des témoins. Le Qc de base des patients n’était pas différent de celui des témoins. Un coefficient de reproductibilité de Qc a été calculé. Nous avons aussi montré que le Qc des témoins, et pas celui des drépanocytaires, augmentait significativement en position couchée par rapport à la position assise.

Discussion: l’absence d’adaptation posturale vasculaire pulmonaire dans la drépanocytose est sans doute secondaire à une baisse de la compliance du lit capillaire due à l’hémolyse intravasculaire, à la dysfonction endothéliale et à la prolifération vasculaire potentiellement à l’origine de l’hypertension pulmonaire artérielle fréquemment rencontrée dans cette maladie.

Conclusion: notre étude confirme la forte incidence du syndrome obstructif chez les enfants drépanocytaires mais pas la diminution du NO expiré. Cette étude valide, chez l’enfant, une technique de référence pour la mesure du Qc par double diffusion NO-CO. Les enfants drépanocytaires présentent un trouble de l’adaptation vasculaire pulmonaire posturo-dépendante sans diminution du Qc basal. Ce test non-invasif pourrait être considéré comme un outil diagnostique dans le suivi de l’atteinte vasculaire pulmonaire dans la drépanocytose.

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EMMPRIN & modulation des MMP

Yacine BOUSSADIA (Travail réalisé sous la direction de Stéphane GALIACY)

Unité INSERM  651 (Directeur Serge ADNOT) Créteil.

Introduction : L’EMMPRIN est un récepteur transmembranaire hautement glycosylé, impliqué dans de nombreux évènements normaux et pathologiques. Depuis sa description initiale dans les cellules tumorales d’origine épithéliale, plusieurs travaux ont montré que l’expression d’EMMPRIN ne leur était pas restreinte, mais était retrouvée aussi dans les lymphocytes T activés, les macrophages, et les cellules épithéliales des épithéliums au cours du développement et au cours de la réparation.

Matériel et Méthodes : Nous avons eu recours dans ce projet à diverses techniques comme le Western blot, la RT- PCR Quantitative, zymogramme et Immunomarquage. Nous nous sommes basé sur un modèle (invivo) de fibrose de rat induite par l’injection intra-trachéale de bléomycine avec des poumons prélevés de J3 à J15. Nous avons utilisé des cellules épithéliales alvéolaire ainsi que des fibroblastes en culture primaire, et trois lignées cellulaires: T3, A549 et HT1080 (in vitro) dans un modèle de blessure et d’induction avec des cytokines. Nous avons aussi réalisé des expériences de co-culture et d’induction par des préparations de membranes de cellules épithéliales.

Résultats : Les cellules épithéliales alvéolaires de rats expriment EMMPRIN après injection intra-trachéale de Bléomycine. EMMPRIN se caractérise par deux bandes correspondant aux formes Hautement Glycosylées  (HG) & Faiblement Gluycosylées (FG) et qui sont respectivement à 55 & 45 KDa. Les lignées T3 et A549, expriment EMMPRIN sous deux formes : à 45 KDa et 55 KDa qui correspondent respectivement aux formes : (FG) et  (HG). Apres inductions par des cytokines (TNF-a, IL1-b, KGF) des lignées T3 et A549 avec ou sans blessure, nous observons qu’elles expriment toutes les deux formes d’EMMPRIN. Au niveau des ARNm, nous observons une nette diminution de la quantité d’ARN d’EMMPRIN pour les cellules induites avec les cytokines et principalement pour l’IL1, dans la lignée A549. Les fibroblastes primaires en présence de membranes de T3 secrètent de la MMP 2 et de la MMP 9.

Discussion :  Dans le modèle de fibrose  pulmonaire induite par injection intra-trachéale de bléomycine chez le rat, nous avons montré une augmentation de l’expression d’EMMPRIN  au cours du développement de la fibrose. Ces résultats rejoignent ceux obtenus chez la souris par d’autres études avec une présence des deux formes HG et  FG chez les témoins et les rats Bléomycine. Les cellules épithéliales alvéolaires de rat en culture primaire ainsi que les lignées T3 et A 549 expriment EMMPRIN in vitro. Après induction sous 24 heures avec des cytokines, EMMPRIN est augmentée dans les A549, en revanche la quantité d’ARNm d’EMMPRIN  dans les T3 est inférieure à celle des contrôles ; Ceci pourrait être lié à un système de rétrocontrôle. Des expériences complémentaires sont en cours pour préciser l’action d’EMMPRIN dans la réparation épithéliale in vitro et ses effets sur la synthèse de MMP

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Hypervascularisation péribronchiolaire dans la mucoviscidose : surexpression épithéliale de VEGF₁₆₅ et régulation par Pseudomonas aeruginosa

S. DANEL (Travail réalisé sous la direction de P.-R. BURGEL)

Service de Pneumologie et UPRES EA 2511, Université René Descartes-Paris 5, Cochin.

Introduction. Les hémoptysies liées à une hypervascularisation bronchique d’origine systémique sont fréquentes dans la mucoviscidose. L’hypervascularisation semble radiologiquement prédominer dans les zones d’infection bronchique. VEGF₁₆₅ est un facteur de croissance impliqué dans l’angiogénèse normale et pathologique. Les liens entre l’hypervascularisation bronchique, l’infection bactérienne et VEGF₁₆₅ sont inconnus dans la mucoviscidose.

Méthodes. A l’aide de marquages immunohistochimiques nous avons évalué la vascularisation péribronchiolaire ainsi que l’expression et la localisation de VEGF₁₆₅. Nous avons étudié les tissus pulmonaires chirurgicaux de sujets Témoins (n=10) et de sujets mucoviscidosiques (explants pulmonaires, n=10). Les marquages ont été quantifiés par analyse morphométrique quantitative. La régulation de la synthèse de la protéine VEGF₁₆₅ par les cellules épithéliales respiratoires a été étudiée sur la lignée de cellules épithéliales NCI-H292.La production de VEGF₁₆₅ a été mesurée par ELISA en absence et en présence de surnageant de culture de Pseudomonas aeruginosa. Le rôle de l’activation du récepteur de l’EGF dans la synthèse du VEGF₁₆₅ a été étudié en utilisant un inhibiteur de la tyrosine kinase du récepteur de l’EGF, l’AG1478, et un anticorps dirigé contre le récepteur de l’EGF, le C225.

Résultats. Il existe une augmentation du nombre et de la surface des vaisseaux péribronchiolaires chez les patients du groupe mucoviscidose (P<0,01 par rapport aux Témoins). L’épithélium bronchiolaire est un site majeur d’expression de VEGF₁₆₅ et la surface épithéliale marquée pour VEGF₁₆₅ est augmentée chez les patients mucoviscidosiques (P<0,01 par rapport aux Témoins). Le surnageant de culture de Pseudomonas aeruginosa provoque une augmentation dose - et temps - dépendante de la synthèse de la protéine VEGF₁₆₅ dans les cellules épithéliales NCI-H292 (P<0,05 ; n=3). Le prétraitement des cellules NCI-H292 par l’AG1478 ou le C225, prévient l’effet du surnageant de culture de Pseudomonas aeruginosa sur la synthèse de la protéine VEGF₁₆₅.

Conclusions. Chez les patients mucoviscidosiques au stade de la greffe, il existe une hypervascularisation péribronchiolaire et une augmentation de l’expression de VEGF₁₆₅ dans l’épithélium bronchiolaire. Les facteurs sécrétés de Pseudomonas aeruginosa induisent la synthèse de VEGF₁₆₅ par des cellules épithéliales par activation du récepteur de l’EGF.

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Effets du tabagisme sur l'activation de la voie Rho kinase chez les fumeurs avec fonction respiratoire normale et chez les BPCO

Introduction. Les Rho-kinases participent à la prolifération, la contraction des cellules musculaires lisses et à la régulation de l’expression de la NO synthase endothéliale. Le rôle des Rho-kinases est connu dans les affections cardiovasculaires, mais la place des Rho-kinases dans le dysfonctionnement endothélial de la BPCO n’a pas encore été clairement établie. Notre hypothèse est que l’expression des Rho-kinases augmente chez les patients atteints de BPCO post-tabagique. Dans cette étude, nous avons évalué l’expression d’un des effecteurs de la RhoA (ROCK-I) chez les fumeurs non-BPCO (9 patients) et chez les BPCO post-tabagiques (10 patients) par rapport aux témoins non-fumeurs (9 patients).

Matériels et méthodes. L’expression des Rho-kinases (ROCK-I) des prélèvements d’artères pulmonaires et de tissus pulmonaire provenant des patients opérés d’un cancer broncho-pulmonaire a été évaluée par immunohistochimie et par western blot. La technique d’immunoperoxidase et de western blot a été réalisée avec l’anticorps primaire spécifique de ROCK-I et l’anticorps secondaire d’immunoglobuline-HRP compatible (Santa Cruz Biotechnologie Inc). Le gel SDS-PAGE 7,5% et la membrane PVDF ont été utilisés pour le transfert et pour la migration des protéines. Les bandes de protéines spécifiques ont été détectées par le kit ECL plus (Amersham, Biosciences) et quantifiées par la méthode de densitométrie (Chemi Genius 2).

Résultats. L’expression de ROCK-I mesurée par immunohistochimie et par western blot est augmentée chez les fumeurs ayant une fonction respiratoire normale et chez les patients atteints de BPCO post-tabagique par rapport aux témoins (p<0,05 et p<0,01 respectivement). L’expression de ROCK-I mesurée par immunohistochimie chez les patients BPCO était supérieure à celle de fumeurs non-BPCO (p<0,05).

Conclusion. L’augmentation de l’expression de ROCK-I dans les vaisseaux pulmonaires  (artérioles pulmonaires et artères pulmonaires proximales) chez les fumeurs et chez les patients atteints de BPCO au stade légère pourrait participer au dysfonctionnement endothélial et à la diminution de la synthèse du NO dans l’hypertension artérielle pulmonaire associée à la BPCO post-tabagique. L’interaction entre le NO et le système Rho/Rho-kinase dans les muscles lisses vasculaires reste à être clarifiée.  

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Propriétés mécaniques cellulaires de la barrière alvéolo-capillaire en milieu inflammatoire. Mise au point d’un modèle d’étude par microscopie à force atomique

S. Ehrmann (Travail réalisé sous la direction de Bruno Louis, Daniel Isabey)

Unité INSERM U651, Créteil

Introduction. Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est caractérisé par des lésions de la barrière alvéolo-capillaire, aggravées par la ventilation mécanique. Le corollaire aux forces d’étirement macroscopiques serait au niveau microscopique l’état mécanique des cellules de la barrière alvéolo-capillaire (tension interne, rigidité), conditionnant les points de ruptures tissulaires. Le but du travail est la mise au point d’un nouveau modèle d’étude de rigidité de cellules alvéolaires en présence de liquide de lavage alvéolaire de patients présentant un SDRA.

Matériels et méthodes. Mesure des propriétés mécaniques de cellules épithéliales et endothéliales pulmonaires humaines en culture utilisant un microscope à force atomique (AFM) avec une extrémité sphérique du cantilever. Evaluation de la reproductibilité de la mesure (dérivée au point d’indentation maximale de la courbe force-déplacement et calcul du module de Young local), de la stabilité de la mesure au cours du temps et de l’effet du milieu de culture et de la cytochalasine D (cyto D).

Résultats. Nous avons observé une bonne reproductibilité de la mesure de la dérivée au point d’indentation maximale, stable au cours du temps et une diminution nette de la rigidité en présence de cyto D. Le calcul mathématique du module de Young présente actuellement une variabilité très importante.

Discussion. La mesure par AFM donne des résultats reproductibles sur deux types cellulaires humains. La mise au point d’un calcul fiable du module de Young local est nécessaire avant de pouvoir tester l’effet de liquides de lavages alvéolaires de patients atteints de SDRA sur la mécanique cellulaire.

Conclusion. La mise au point d’une mesure de rigidité cellulaire par AFM dans le poumon lésionnel semble réalisable mais nécessite un temps d’optimisation supplémentaire pour être considéré comme fiable et reproductible.

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Influence de la colonisation des voies aériennes par Candida albicans sur l’émergence de pneumopathies bactériennes chez le rat

S. Gaudry (Travail réalisé sous la direction de J.D. Ricard et G. Saumon)

INSERM U722, Bichat, Paris

Introduction : Des études chez l’homme et l’animal suggèrent que la colonisation broncho-pulmonaire à C. albicans facilite l’apparition de pneumopathies à P. aeruginosa. Nous avons testé les hypothèses 1) que des cytokines produites lors de cette colonisation ainsi que des éléments structuraux de C. albicans pourraient favoriser la croissance de P. aeruginosa et 2) que l’interaction entre C. albicans et P. aeruginosa était spécifique.

Matériels et méthodes : Des courbes de croissance de P. aeruginosa ont été réalisées en présence des cytokines pro-inflammatoires TNF-α, IFN-γ et IL-6, ou de C. albicans tué et fixé à l’alcool. Afin de tester la spécificité de l’interaction C. albicans-P. aeruginosa, des rats dont les voies aériennes étaient colonisées ou non par C. albicans ont reçu un faible inoculum de S. aureus. Les poumons des rats ont été évalués au point de vue macroscopique, microscopique et microbiologique. Des dosages pulmonaires et plasmatiques de TNF-α ont été effectués.

Résultats : La croissance de P. aeruginosa n’a pas été influencée par les cytokines pro-inflammatoires ni par C. albicans tué. En présence d’une colonisation broncho-pulmonaire à C. albicans, le nombre de pneumopathies macroscopiques ainsi que les comptes de S. aureus dans les poumons étaient significativement plus importants par rapport aux rats non-colonisés (respectivement p<0,01 et p<0,001). La concentration de TNF-α était plus élevée dans les poumons des rats colonisés par C. albicans et instillés avec S. aureus que dans ceux des rats ayant reçu S. aureus seul.  

Discussion : Aucune des cytokines évaluées ne favorise la croissance de candida albicans. Il semble donc que la réaction inflammatoire induite par la colonisation des voies aériennes par C. albicans n'explique pas à elle seule les résultats observés in vivo. Les mécanismes mis en jeu ne semblent d'ailleurs pas spécifiques de P. aeruginosa puisque cette colonisation favorise aussi l'émergence de pneumopathie à S. aureus.

Conclusion : La colonisation broncho-pulmonaire à C. albicans est un facteur de risque de pneumopathie bactérienne à germes fréquemment impliqués dans les infections nosocomiales. Un traitement antifongique préemptif pourrait être intéressant dans le but de réduire l’incidence des pneumonies nosocomiales.

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Polymorphisme du gène MMP-2 et risque de dysplasie bronchopulmonaire chez le prématuré né à moins de 28 SA.

Isabelle HALPHEN (Travail réalisé sous la direction du Professeur Christophe DELACOURT).
Unité INSERM U651 (Directeur : Serge ADNOT), Créteil.

Introduction. La dysplasie bronchopulmonaire (DBP) représente une séquelle pulmonaire de la grande prématurité. Elle correspond à des anomalies du développement alvéolaire et se traduit par une oxygénodépendance à 36 semaines d’aménorrhée. Il a été montré dans notre laboratoire qu’un taux bas de MMP-2 dans les effluents trachéaux de prématurés humains était prédictif du risque de DBP (C.Danan et al.). L’allèle T du polymorphisme C/T en -1306 du gène MMP-2 est responsable d’un niveau d’expression plus bas de la protéine. Nous avons donc voulu rechercher une association entre l’allèle T du polymorphisme C/T en -1306 du gène MMP-2 et : le risque de survenue d’une DBP chez les grands prématurés ou : le taux de MMP-2 dans les effluents trachéaux.

Matériels et méthodes. Cette étude s’intègre dans un projet plus global testant l’hypothèse d’une composante génétique associée au risque de survenue d’une DBP. Ce travail est réalisé à partir de l’ADN génomique extrait du sang de cordon de prématurés (terme inférieur à 28 SA) et d’effluents trachéaux prélevés à J0, J3 et J5. Le génotype C/T en -1306 du gène MMP-2 est identifié grâce à l’introduction d’un site de restriction au niveau du site polymorphique. Le dosage de MMP-2 dans les effluents trachéaux se fait par ELISA.

Résultats. La distribution allélique varie en fonction de l’ethnie, aucun enfant originaire d’Afrique noire n’ayant d’allèle T. Il n’a pas été retrouvé de lien entre le fait de porter l’allèle T et le risque de développer une DBP. Le taux moyen de MMP-2  à J0 dans les effluents trachéaux est plus bas chez les patients CT ou TT que chez les patients CC. Ce résultat n’est toutefois pas significatif.

Discussion. Nous ne reproduisons pas de façon significative les résultats précédemment obtenus, concernant le caractère prédictif de la MMP-2 à J0 pour le développement ultérieur de la DBP (mais populations et techniques de dosage de la MMP-2 différentes). De plus, notre étude manque de puissance du fait de l’hétérogénéité ethnique et du  nombre encore limité d’enfants inclus.

Conclusion. Les études d’associations génétiques comportent de nombreux biais. L’hétérogénéité de la population étudiée peut être responsable de faux négatifs, d’où la nécessité d’inclure un grand nombre de patients. D’autre part, une approche multigénique semble plus fiable du fait de la complexité des mécanismes participant au développement de la dysplasie bronchopulmonaire (DBP).Notre programme de recherche doit s’étendre à l’ensemble des gènes contrôlant le renouvellement matriciel dans le développement pulmonaire.

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Dysfonction endothéliale pulmonaire et tabagisme : rôle de la balance NOS/arginases

Priscilla HENNO (Travail réalisé sous la direction de C. Delclaux)

EA 4068, Saints-Pères, Paris

Introduction : Une dysfonction endothéliale associée aux BPCO avérées est maintenant bien connue, mais ses mécanismes le sont moins. La production de NO, puissant vasorelaxant et antiprolifératif sur les CML, étant gouvernée par une balance entre deux systèmes enzymatiques (NO synthases et arginases), nous avons étudié le rôle de ces enzymes sur la vasoréactivité pulmonaire humaine en relation avec le tabagisme.

Méthodes : Vingt deux sujets ont été analysés, 11 fumeurs sans trouble ventilatoire obstructif et 11 non fumeurs. Des anneaux artériels pulmonaires obtenus sur leurs pièces d’exérèse chirurgicale ont fait l’objet d’études pharmacologiques testant la relaxation à l’acétylcholine, le rôle de la L-arginine, et des bloqueurs d’arginases (NorNOHA et BEC). Les différences entre les groupes ont été comparées par un test ANOVA pour mesures répétées. Par ailleurs l’expression tissulaire de ces cinq protéines (NOS 1 à 3, arginases I et II) a été immunolocalisée et semi-quantifiée (IHC) sur les structures vasculaires (cellules endothéliales et cellules musculaires lisses).

Résultats : Les fumeurs présentent une dysfonction endothéliale caractérisée par un défaut de relaxation à l’Ach (p < 0,05), en l’absence même, parfois, de toute altération de la fonction respiratoire. La supplémentation en L-arginine accentue cette dysfonction. Le blocage pharmacologique des arginases ne restaure pas de vasorelaxation. Il existe une sous-expression des 3 NOS chez les fumeurs au niveau des structures vasculaires pulmonaires.

Conclusions : Nos résultats confirment la dysfonction endothéliale pulmonaire associée au tabagisme et seraient en faveur d’une atteinte vasculaire précoce précédant tout retentissement ventilatoire du tabagisme. Une sous-expression vasculaire des NOS chez les fumeurs pourrait être à l’origine d’un défaut de production du NO. L’impact  de la L-arginine sur la déviation de la balance enzymatique en faveur des NOS ou des arginases reste à élucider. Certains mécanismes qui pourraient sous-tendre un déséquilibre de la balance NOS/arginases sont actuellement à l’étude, essentiellement stress oxydant et NF-kB.

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Rôle des macrophages intravasculaires pulmonaires dans le développement du syndrome hépatopulmonaire

F. NICOLAS-JILWAN

 (travail réalisé sous la direction de M. Philippe HERVE)

Laboratoire de Chirurgie Expérimentale, CCML, UPRES EA 2705

Introduction : Le syndrome hépatopulmonaire (SHP) peut compliquer l’hypertension portale. Un modèle reproductible de ce SHP chez le rat est la ligature de la voie biliaire principale responsable du développement d’une cirrhose (CBS ou cirrhose biliaire secondaire). La physiopathologie du SHP est mal connue soutenue par l’hypothèse inflammatoire incriminant des macrophages recrutés dans les vaisseaux pulmonaires. Nous testons cette hypothèse en administrant à des rats cirrhotiques du chlorure de gadolinium, un inhibiteur des macrophages, et en étudiant ses répercussions sur le SHP.

Matériels et Méthodes : 5 groupes de rats sont étudiés, un groupe SHAM, un groupe de CBS traité par du chlorure de gadolinium (CG) à 10mg/Kg selon un protocole à visée préventive (CBS+CG 1), un groupe de CBS traité par 4 injections de placebo, un groupe de CBS traité selon un protocole à visée thérapeutique (CBS+CG2) et un groupe de CBS recevant aussi 2 injections de placebo. Les animaux sont sacrifiés à la 5^ème semaine post-opératoire. Une étude des gaz du sang permet d’évaluer le shunt et la sévérité du SHP, les répercussions  hémodynamiques par un cathétérisme carotidien gauche et jugulaire droit, Une quantification de la translocation bactérienne d’origine digestive, par des divers prélèvements.

Résultats : L’incidence du SHP n’est pas modifiée par le chlorure de gadolinium (73,3% chez les CBS traités par du placebo, 55% chez les CBS+CG1 et 50% chez les CBS+CG2). Par contre, la sévérité du SHP est nettement réduite surtout dans le groupe CBS+CG1 avec une moyenne de PO2 (89.87 mmHg±5.22) rejoignant celle du groupe SHAM (89.08mmHg±2.62) et différant de façon significative du groupe CBS non  traité (72.32 mmHg±4.72). De même, l’atteinte hépatique est moins sévère chez les rats CBS traités selon les 2 protocoles par le CG avec une bilirubine moins élevée, moins d’hypertension portale et moins de fibrose hépatique. Les résultats des explorations hémodynamiques montraient la persistance d’un sydrome hyperkinétique avec un index cardiaque élevé et des résistances vasculaires abaissés dans les 2 groupes traités avec des valeurs restants identiques aux groupes CBS non traités. De même, le risque de translocation bactérienne et la mortalité à 5 semaines étaient non significativement différentes entre les groupes traités et non traités.

Discussion : l’atteinte hépatique est moins sévère après traitement par du CG, en rapport probablement avec l’inhibition des macrophages intrahépatiques, les cellules de Kupffer. Une confirmation de ces résultats devrait se faire par un dosage ultérieur du tumor growth factor beta.

Le SHP est moins sévère après le blocage des macrophages intravasculaires mais son incidence n’est pas modifiée mettant l’accent sur l’incrimination d’autres facteurs physiopathologiques encore inconnus.

Conclusion : L’inhibition des macrophages intravasculaires pulmonaires dans la CBS permet de réduire la sévérité du SHP, mais aussi la sévérité de l’atteinte hépatique.

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Etude de l’effet cumulé de la corticothérapie anténatale et de la chorioamniotite sur le développement pulmonaire fœtal à partir dans un modèle expérimental chez le lapin.

Nicolas JORAM (Travail réalisé sous la direction de Christèle Gras-Le Guen).

Laboratoire d’antibiologie EA 3826, Nantes (Directeur : Gilles Potel)

En collaboration avec l’unité INSERM 651, Créteil (Directeur : Serge Adnot)

Introduction. L’infection materno-foetale constitue un facteur de risque de dysplasie broncho-pulmonaire. Certaines études animales mettent par ailleurs en évidence les effets délétères de la corticothérapie anténatale sur le développement pulmonaire. A partir d’un modèle expérimental chez le lapin, nous avons étudié les effets cumulés de la chorioamniotite et de la corticothérapie anténatale sur le développement pulmonaire et sur les processus infectieux et inflammatoire.

Materiel et méthodes.  Les lapines inoculées à J25 de gestation par 10³ Escherichia coli  recevaient une antibiothérapie et une ou deux doses de bétamethasone (0,1 mg/kg/dose) ou du sérum physiologique, 6 heures après l’inoculation. Un quatrième groupe recevait une corticothérapie en l’absence d’inoculation et un dernier groupe ne recevait ni inoculation, ni corticothérapie. Les fœtus survivants étaient étudiés le jour de leur naissance. Leur développement alvéolaire était étudié par méthode morphométrique. Les processus infectieux et inflammatoires étaient étudiés par culture tissulaire, hémocultures et analyse de la cellularité du liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA).

Résultats. Par rapport au groupe témoin et aux lapereaux exposés à une infection seule les lapereaux exposés à une infection et une corticothérapie présentaient une mortalité néonatale supérieure, et un poids de naissance et un volume pulmonaire diminués (p<0,05). Dans le groupe exposé à une chorioamniotite et deux doses de glucocorticoïde, la surface alvéolaire, le volume interstitiel et la longueur des fibres élastiques était abaissés (p<0,05).Les lapereaux exposés à l’infection et/ou une corticothérapie présentaient une prolifération cellulaire moins importantes que le groupe témoin. L’ensemble des prélèvements bactériologiques était négatif et aucune différence n’a été mise en évidence en terme de cellularité du LBA.

Discussion. Cette étude a mis en évidence les effets délétères de la corticothérapie en contexte de chorioamniotite sur le développement alvéolaire et en particulier sur l’élastogénèse et la prolifération cellulaire. L’étude de l’inflammation était probablement trop tardive par rapport au début du processus infectieux et à la corticothérapie pour observer des différences

Conclusion. Même si son intérêt en pratique clinique ne peut être remis en cause, la corticothérapie anténatale présente des effets délétères qui incitent à l’utiliser avec modération et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

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Culture de cellules de morphologie mésenchymateuse à partir du lavage bronchiolo-alvéolaire (LBA) de patients porteurs d’adénocarcinome pulmonaire

A. Lavolé (Travail réalisé sous la direction de J. Cadranel)

UPRES EA 3493, Hôpital Tenon, Paris

Introduction : A partir de la culture de cellules tumorales provenant des LBA de patients atteints d’ADC-CBA, nous avons constaté la présence de cellules de morphologie mésenchymateuse dont la nature n’a jamais été précisée. Le but du travail était de cultiver et caractériser ces cellules.

Matériels et méthodes : Cinq LBA de patients atteints d’ADC-CBA et 7 LBA témoins ont servi à l’étude. L’extraction de fibroblastes témoins a été réalisée à partir de prélèvements chirurgicaux en zone pulmonaire saine de 5 patients opérés pour un cancer du poumon. Les techniques ont consisté à faire de la culture cellulaire et de l’immunocytochimie afin de caractériser les cellules obtenues.

Résultats : Nous avons observé l’apparition de cellules de morphologie mésenchymateuse dans les cultures de tous les LBA ADC-CBA et dans aucune culture des LBA témoins. Le phénotype de ces cellules était différent de celui des fibroblastes pulmonaires témoins. Dans 4/5 cas, il s’agissait de cellules en transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) (vimentine +, prolyl 4 hydroxylase +, Actine a du muscle lisse +, CK +, CK7 + et CD45 -) et dans 1/5 cas, il s’agissait de myofibroblastes (vimentine +, prolyl 4 hydroxylase +, Actine a du muscle lisse +, CK -, CK7 - et CD45 -). Les cellules issues des LBA ADC-CBA conservaient une capacité de produire CXCL12, mais plus faible que celle des fibroblastes pulmonaires normaux.

Conclusion : La présence de cellules en TEM dans les LBA ADC-CBA soulève la question de leur nature tumorale.

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Etude des polymorphismes du gène du récepteur aux glucocorticoïdes chez les patients atteints de mucoviscidose

Nadia NATHAN (Travail réalisé sous la direction de Hariet CORVOL)

Inserm, UMR-S 719, Paris

Introduction : La mucoviscidose, la plus fréquente des maladies létales autosomiques récessives dans la population caucasienne, est due à des mutations du gène codant la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). L’atteinte pulmonaire, facteur majeur de morbidité et de morbidité de la maladie, s’accompagne d’une inflammation intense des voies aériennes. Elle est caractérisée par une hétérogénéité phénotypique importante, liée aux mutations du gène CFTR mais également à des facteurs génétiques situés en dehors du locus CFTR, appelés gènes modificateurs.

Matériel et méthodes : Les corticoïdes endo- et exogènes possédant des propriétés anti-inflammatoires, nous avons étudié quatre polymorphismes du gène du récepteur aux glucocorticoïdes (GR) impliqués dans le métabolisme des glucocorticoïdes (GC) (TthIII1, ER22/23EK, N363S et Bcl1) dans une cohorte de 275 enfants atteints de mucoviscidose. Nous avons recherché des associations entre les différents génotypes et le phénotype respiratoire, pancréatique, nutritionnel et infectieux des patients.

Résultats et discussion :.Nous montrons que le polymorphisme Bcl1 est significativement associé à la pente de déclin de la fonction respiratoire. En effet, les patients de génotype Bcl1 CC ont une pente de déclin de la fonction respiratoire, VEMS et CVF, moins prononcée que les patients Bcl1GG et GC. Cette association est significative chez les patients insuffisants pancréatiques (p=0,02 pour le VEMS et p=0,04 pour la CVF) ainsi que lorsque l’analyse est réalisée chez les patients homozygotes F508del (p=0,015 pour le VEMS et p=0,025 pour la CVF). Nous n’avons pas montré d’association entre les trois autres polymorphismes et les caractéristiques phénotypiques des patients

Conclusion : Nous montrons que l’allèle C du polymorphisme Bcl1 du GR est protecteur vis à vis de la dégradation de la fonction pulmonaire chez les patients atteints de mucoviscidose. Les perspectives de ce travail seront de réaliser des études fonctionnelles du GR dans la mucoviscidose. Les résultats devront permettre d’améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la variabilité de la réponse au traitement par glucocorticoïdes inhalés chez les patients atteints de mucoviscidose.

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Coordination entre la déglutition et la respiration des patients neuromusculaires et effet de la ventilation mécanique.

Nicolas TERZI (Travail réalisé sous la direction de F.LOFASO)

Centre d’Innovations Technologiques, Hôpital Raymond Poincaré, Garches.

Introduction : L’analyse des interactions entre la déglutition et la respiration des patients neuromusculaires pourrait améliorer la compréhension et donc prévention des risques d’inhalation. Le but de cette étude est l’analyse descriptive de ces interactions et l’évaluation de l’intérêt d’une ventilation mécanique au cours du repas pour les patients trachéotomisés.

Matériels et méthodes : Dix sujets sains et vingt-deux patients porteurs d’une maladie neuromusculaire compliquée d’insuffisance respiratoire chronique ont été inclus. Les ingestions de trois volumes d’eau (5, 10 et 15ml) ont été évaluées par enregistrement électromyographique et mécanique des muscles de la déglutition, et enregistrement de la ventilation par pléthysmographie d’inductance.  Les comparaisons entre les groupes ont été effectuées en utilisant une analyse de variance avec mesures répétées et un test à posteriori. L’impact de la ventilation mécanique a été évalué pour huit patients trachéotomisés ayant pu réaliser le test en ventilation spontanée et sous ventilation mécanique.

Résultats : Comparés aux sujets sains les patients neuromusculaires fragmentent leur déglutition en une ou plusieurs gorgées (test à posteriori, Bonferroni p< 0.0001) isolées ou regroupées au sein d’un ou plusieurs cycles ventilatoires (test à posteriori, Bonferroni p< 0.0001). Alors que la déglutition se termine quasi systématiquement par une expiration chez les sujets sains elle se termine aléatoirement soit par une inspiration, soit par une expiration chez les patients. Enfin, lorsqu’ils sont trachéotomisés, les patients déglutissent plus rapidement (p=0.0005) et en moins de gorgées (p=0.007) sous ventilation mécanique qu’en ventilation spontanée.

Discussion et Conclusion. : Les interactions entre la ventilation et la déglutition des patients neuromusculaires contribuent à un risque de fausses routes. Ce risque pourrait être diminué par la ventilation mécanique des patients trachéotomisés. Ces résultats suggèrent fortement de proposer aux patients neuromusculaires trachéotomisés de rester sous ventilation mécanique durant les périodes de repas.

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